Résolution lipidique dans les cellules vivantes : une nouvelle avancée dans la microscopie photoacoustique hyperspectrale dans l'infrarouge moyen

Les lipides ne sont pas seulement des composants structurels des membranes cellulaires et des molécules de stockage d’énergie, mais ils sont également étroitement liés à l’apparition et au développement du cancer, de l’obésité, du diabète, des maladies cardiovasculaires et des maladies neurodégénératives. Cependant, observer et distinguer directement différents types de lipides dans les cellules vivantes a longtemps été confronté à des défis techniques. Les méthodes traditionnelles de marquage fluorescent sont limitées par l’efficacité, la spécificité et l’interférence potentielle avec les fonctions cellulaires, tandis que les techniques optiques sans marquage ont souvent du mal à distinguer les molécules lipidiques ayant des structures chimiques similaires.

Nature Methods a publié une étude introduisant une technologie appelée « microscopie photoacoustique hyperspectrale de la région des empreintes digitales » (hyFOPM). En utilisant les modes de vibration à liaison unique dans la région des empreintes digitales infrarouge moyen, cette technologie permet une détection sans étiquette et une imagerie dynamique de la sphingomyéline (SM) et du cholestérol (Chol) dans les cellules vivantes.

Principes techniques
La plupart des méthodes optiques sans étiquette reposent sur des signaux dans la région de vibration d'étirement CH (environ 2 800 à 3 000 cm⁻¹), mais les bandes spectrales de cette région sont très similaires entre différents lipides, ce qui rend difficile la distinction entre les différents types. En revanche, la région de l'empreinte digitale infrarouge moyen (900-1 730 cm⁻¹) contient davantage d'informations sur les vibrations des liaisons simples, reflétant la structure unique des molécules, telles que l'absorption caractéristique des liaisons amide, des liaisons ester et des anneaux stéroïdes.

La conception du système hyFOPM est centrée sur ce concept. Il utilise un laser à cascade quantique accordable comme source d'excitation, couvrant la plage 900-2932 cm⁻¹ avec une résolution spectrale de 2 cm⁻¹. Les impulsions laser excitent l'échantillon pour générer des signaux photoacoustiques, qui sont détectés par un transducteur ultrasonique pour construire des images hyperspectrales. Le système a une résolution spatiale d’environ 4,3 μm, permettant l’imagerie au niveau des cellules vivantes.

Validation des modèles lipidiques
Pour vérifier la faisabilité de la technologie, l’équipe de recherche a d’abord préparé des modèles de solutions lipidiques bidimensionnelles contenant du cholestérol (Chol), de la phosphatidylcholine insaturée (DOPC) et de la sphingomyéline (SM).

(1) Comparaison des caractéristiques spectrales

Les spectres de régions d'empreintes digitales collectés par hyFOPM sont hautement cohérents avec les résultats ATR-FTIR. Les trois lipides présentent des pics spectraux distinctifs : le cholestérol présente un fort pic d'absorption pour la déformation de l'anneau stéroïde à 1 056 cm⁻¹ ; DOPC présente une vibration d'étirement C=O du groupe ester à 1 731 cm⁻¹ ; et la sphingomyéline correspond à la bande amide I, à la bande amide II et à la vibration de flexion du CH₂ de l'acide gras à 1 645 cm⁻¹, 1 555 cm⁻¹ et 1 464 cm⁻¹, respectivement.

(2) Capacité de démixage et de classification spectrale
Lorsque l’on utilise seulement 15 nombres d’onde dans la région de l’empreinte digitale pour un démélange linéaire, la diaphonie entre le cholestérol et la sphingomyéline est proche de 0 %, tandis que la diaphonie pour le DOPC est de 23 %. En revanche, la diaphonie augmente considérablement lors de l’utilisation de 7 nombres d’onde dans la région d’étirement CH. Une application plus approfondie de l'analyse discriminante linéaire (LDA) montre que la précision moyenne de la classification atteint 96 % lors de l'utilisation de la région d'empreinte digitale ou de la région CH, et atteint 97 % lors de l'utilisation de tous les nombres d'onde.

(3) Modèles de vésicules unilamellaires géantes (GUV)
L'étude a préparé trois types de GUV pour simuler les membranes cellulaires : le modèle 1, un mélange 1:1 de SM et de Chol, formant une membrane ordonnée dense ; Modèle 2, un mélange 2:2:1 de DOPC, SM et Chol, coexistant dans des phases liquides ordonnées et liquides désordonnées ; et modèle 3, DOPC pur, formant une membrane fluide désordonnée. Les images acquises par hyFOPM à 2852 cm⁻¹ sont morphologiquement cohérentes avec celles obtenues par coloration fluorescente Nile Red. Les caractéristiques spectrales des différentes vésicules correspondent à des lipides purs, confirmant que les composants individuels des membranes mixtes peuvent être identifiés.

(4)Applications de contrôle de qualité
En effectuant des mesures spectrales sur 10 GUV différents pour chaque type et en traçant des diagrammes de phase ternaire, l'équipe de recherche a constaté que la composition lipidique réelle s'écartait du rapport cible (un écart d'environ 40 %). Cela indique que hyFOPM peut être utilisé pour l’évaluation de la qualité de la préparation du GUV.

Applications dans les cellules vivantes
L’étude a en outre appliqué le hyFOPM aux cellules vivantes, en observant les changements dynamiques de la sphingomyéline et du cholestérol dans deux modèles cellulaires, respectivement.

(1) Accumulation de sphingomyéline dans les cellules A549
Les cellules d'adénocarcinome du poumon humain (A549) ont été traitées avec le composé antitumoral acide 2-hydroxyoléique (2-OHOA), qui devrait induire l'accumulation de sphingomyéline. Les spectres de régions d'empreintes digitales (1 600 à 1 400 cm⁻¹) ont été collectés à partir de 50 cellules, montrant que la surface maximale de 1 464 cm⁻¹ a augmenté de 117 % après le traitement, contre seulement 23 % dans le groupe témoin au cours de la même période. Par la suite, l'imagerie a été réalisée sur 3 000 cellules en utilisant seulement quatre nombres d'onde (2 852 cm⁻¹ pour les lipides totaux, 1 540 cm⁻¹ pour la protéine amide II, 1 464 cm⁻¹ pour la sphingomyéline et 1 048 cm⁻¹ pour le cholestérol). Les résultats ont montré que le signal de la sphingomyéline a continué à augmenter 48 et 72 heures après le traitement, tandis que le signal du cholestérol n'a montré aucun changement significatif.

(2) Chargement de cholestérol dans les cellules HEK
Des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293) ont été co-incubées avec un complexe méthyl-β-cyclodextrine-cholestérol (MβCD-Chol) pour augmenter le cholestérol dans la membrane cellulaire. Les spectres de régions d'empreintes digitales de 50 cellules ont montré que la surface du pic de 1 048 cm⁻¹ a augmenté de 161 % après le traitement, tandis que le pic de 1 464 cm⁻¹ pour la sphingomyéline a légèrement diminué, ce qui est cohérent avec la propriété connue selon laquelle la cyclodextrine extrait certains lipides membranaires tout en délivrant du cholestérol. L'imagerie multi-nombre d'onde de 3 000 cellules a en outre confirmé l'élévation du signal du cholestérol, avec une légère augmentation du signal lipidique total et peu de changement dans le signal protéique.

Importance et perspectives
Cette étude démontre la capacité de distinguer des molécules lipidiques ayant des structures chimiques similaires dans des cellules vivantes sans marquage. Comparé aux méthodes traditionnelles reposant sur le marquage fluorescent ou isotopique, hyFOPM évite des problèmes tels que l’efficacité du marquage et les interférences avec les fonctions cellulaires, et sa sélectivité peut être adaptée de manière flexible aux caractéristiques spectrales des lipides cibles en ajustant les nombres d’onde d’excitation.

La spécificité spectrale du système actuel dans la région des empreintes digitales est supérieure à celle de la région d'étirement CH, ce qui ouvre la possibilité de distinguer davantage de sous-types lipidiques. L’étude souligne également que la combinaison de techniques avancées de démixage spectral, telles que l’apprentissage profond, devrait améliorer encore la sensibilité et la spécificité. De plus, la microscopie photoacoustique dans l'infrarouge moyen peut atteindre une profondeur d'imagerie de plus de 150 μm dans les tissus, et les applications futures pourront être étendues à des échantillons épais ou à des environnements in vivo. L'accélération technologique (par exemple, le sous-échantillonnage spectral) et la miniaturisation du système sont des orientations importantes pour faire progresser cette technologie vers l'analyse sur le lieu d'intervention ou les tests de routine en laboratoire.